肾纤维化是慢性肾bing（CKD）发展的中枢bing理特征之一，进展为肾间质细胞外基质（ECM）的相配千里积和成纤维细胞的握续激活，严重影响患~者的肾功能和生存质料。在稠密促纤维化因子中，升沉助长因子-β1（TGF-β1）是公认的肾纤维化主要调控因子。因此，靶向TGF-β1过火下贱分子一直被合计是抗CKD yao物建设的缺欠标的和政策。在长期的生存实验中，多数的传统草yao已被用于治~疗纤维化关连疾bing，然而其有用要素及分子机制尚未被皆备汇报。黄芫花(Wikstroemia chamaedaphne)因富含抗纤维化自然产品（NPs）被凡俗用于民间yao物治~疗水肿（肾脏关连疾bing最高出的进展之一）。为此，中山大学第一附庸病院运筹帷幄团队围绕黄芫花伸开运筹帷幄，发现黄芫花粗提物（CE） 在减轻肾纤维化方面进展出权臣效率。进一步区分得到的化合物15（dapnepeduin A, DA）通过靶向Cdc42介导GSK-3β/β-catenin信号通路大致消弱肾纤维化。从而揭示了DA当作一种自然开头的小分子抗纤维化yao物的遍及后劲，为肾纤维化的治~疗提供了新的分子靶点和政策。咱们凭借先进的肾脏组织分析工夫，为默契肾脏疾bing的分子机制、筛选潜在靶点以及评价yao物疗效提供了有劲扶助。底下奴隶小编沿途来望望这项运筹帷幄吧~
1、DA当作肾成纤维细胞活化有用扼制剂的发现
伸开剩余90%运筹帷幄不雅察到黄芫花粗提物（CE）权臣减轻小鼠肾纤维化，如图1A所示。在图1B中，TGF‐β1厚实指引肾成纤维细胞中α‐SMA的抒发和ECM的产生，而CE从5µg/mL运转导致这些纤维化意见的抒发呈剂量依赖性下落，标明其扼制肾成纤维细胞的激活的有用活性。
为了进一步跟踪CE中的活性要素，运筹帷幄东说念主员对其进行了区分并区分出16种二萜（1-16），其中化合物15 （dapnepeduin A，DA）的活性最强。在ECM方面，DA在候选化合物中对纤维联络卵白和I型胶原的扼制效率也最为高出（图1D）。同期，在MTS实验中，DA对成纤维细胞呈低毒性，在10µM时细胞存活率为>90%。因此，计划到疗效和安全性，运筹帷幄东说念主员选择DA当作有远景的先导物进行进一步的运筹帷幄。该化合物以剂量和时候依赖性的神志缩短了纤维化标志物的抒发（图1E，F）。
总而言之，评释黄芫花的主要要素DA不错权臣扼制肾成纤维细胞的激活和ECM的产生。
图1. 在TGF-β1激活的肾成纤维细胞中，DA当作一种有用的抗纤维化化合物
2、DA扼制肾小管细胞上皮-间充质升沉成纤维细胞的活化
活化的肾纤维细胞具有增强增殖和搬动能力，导致肾纤维化bing变的产生。因此，运筹帷幄东说念主员接下来对DA在活化的肾纤维细胞中的作用进行了探究。通过对TGF-β1、血管垂危素II、白细胞介素17、脂多糖、白细胞介素-1β等指引的肾纤维细胞中α-SMA和ECM抒发进行运筹帷幄发现，DA阻断了α-SMA和ECM的抒发且展现出对活化纤维细胞的增殖和搬动能力的扼制作用。同期，DA还被发现大致扼制上皮间质升沉（EMT）的发生，收复上皮象征物E-钙黏卵白的抒发并缩短基质象征物（纤连卵白和微丝卵白）的抒发。DA展现出权臣的抗纤维化活性。
图2. DA阻断肾成纤维细胞的活化和肾小管细胞的EMT
3、DA减轻UUO小鼠肾纤维化模子
为了评估DA在体内的抗纤维化作用，运筹帷幄接受了UUO小鼠模子，手~术后7天赐与低剂量（LD）和高剂量（HD） DA。与对照组比拟，DA权臣下调了UUO小鼠肾脏中Acta2（编码α‐SMA）、Col1a1、Col3a1（编码胶原）和Fn1（编码纤维联络卵白）mRNA水平以及相应的卵白质水平（图3A，B）。低剂量DA组在减少这些纤维化调遣因子方面得回了与PFD组（阳性对照组）雷同的效率。高剂量DA比PFD组进展出更好的效率，这扶助了DA刚劲的抗肾纤维化活性。从血清肝酶（天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT））水和睦体重下落不错看出，DA给yao并未指引小鼠明显的全身毒性（图3D，E）。
将yao物分拨到预定的部位关于进步疗效和减少反作用至关缺欠，因此运筹帷幄接受了凡俗使用的高效液相色谱-串联质谱（HPLC - MS/MS）措施来检测不同器官中的含量。如图3F所示，在肾脏和肝脏中，在色谱上都发现了DA的峰，况兼DA在肾脏中似乎更富集；肺、心、脾均未见DA峰。
总而言之，DA是一种有用的肾保护剂，可在体内减轻小管间质纤维化，具有较高的疗效和安全性。
图3. DA对UUO小鼠肾纤维化有保护作用
4、DA减少活化成纤维细胞中β-Catenin的积存
为了汇报DA抗纤维化作用的分子机制，运筹帷幄进行了转录组测序。斥逐显现，两组互异抒发基~因1593个，经DA处置后基~因上调1074个，迪士尼彩乐园下调519个（图4A）。KEGG分析显现，DA对Wnt信号通路证据了权臣述用，而不是假设的促纤维化TGF-β/Smads信号通路（图4B）。DA阻断TGF-β1指引的β-catenin上调（图4C）。发现DA权臣扼制TGF-β1刺激的β-catenin细胞质和细胞核积存，Wnt/β-catenin信号激活的主要特征以及纤维化基~因转录（图4D，E）。同期，在多个肾成纤维细胞和小管细胞模子中检测到DA对多样刺激指引的β-catenin水平的扼制作用。这些发现进一步扶助了DA扼制β-catenin挣扎肾纤维化。
图4. DA促进了β-catenin在S33/37/45/T41位点的磷酸化，并促进β-catenin泛素化降解
DA增多了肾成纤维细胞中β-catenin (Ctnnb1) 的mRNA水平，因此假设DA介导的β-catenin的下调可能是由于卵白质降解。训戒证，DA能促进β-catenin水解（图4F）。此外，运筹帷幄团队还分析了DA对β-catenin泛素化修饰的影响，斥逐显现DA处置可援助TGF-β1还原的β-catenin泛素化（图4G）。β-catenin的泛素化卵白水解受到特定位点磷酸化情状的严格弃世，举例Ser33/37/45和Thr41位点，运筹帷幄发现TGF-β1权臣缩短了β-catenin在Ser33/37/45/Thr41位点的磷酸化，这不错被DA拮抗从而促进β-catenin的降解（图4H）。这些运筹帷幄斥逐标明，DA通过上调β-catenin 在Ser33/37/45/Thr41残基的磷酸化促进了β-catenin的泛素化卵白水解。
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这些不雅察斥逐标明，DA的抗纤维化活性主要依赖于对促纤维化β-catenin信号通路的阻断。
5、DA减轻UUO小鼠肾纤维化模子
为了考证DA在体内是否也靶向β-catenin信号传导，运筹帷幄团队评估了用载体或DA处置的UUO小鼠肾脏中总β-catenin和磷酸化水平。与培养成纤维细胞的斥逐个致，DA以剂量依赖的神志缩短了UUO肾脏中β-catenin的抒发（图5A）。同期，DA处置不错援助UUO样品中β-catenin促降解磷酸化Ser33/37/45/Thr41位点的减少，扶助DA促进体内β-catenin泛素化卵白水解的假设（图5B）。免疫组织化学染色显现，在纤维化肾脏中β-catenin升高主要位于小管和小管间质，不错通过给yaoDA舍弃（图5C）。高剂量DA使UUO肾脏收复到接近健康小鼠的水平。
图5. DA增多了UUO肾脏中p-β-catenin (S33/37/45/T41)，缩短了总β-catenin含量
6、DA通过扼制Cdc42活性阻断促纤维化β-Catenin信号传导
运筹帷幄接受热卵白组学政策进一步运筹帷幄了DA阻断纤维化促进的β-catenin信号通路的yao理机制。通过筛选笃定了Cdc42可能是DA的靶标卵白，并发现Cdc42在细胞质中起着缺欠的信号转导作用。随后通度日性Cdc42 pull-down实验、细胞热编削实验（CETSA）、名义等离子共振（SPR）等考证了这一斥逐。此外，期骗分子对接和残基突变实验发现Leu119和Lys128是DA与Cdc42纠合的要道位点。这些发现进一步揭示了DA的yao理机制。
图6. DA径直与Cdc42纠消失扼制其活性
7、DA依赖Cdc42调控p-PKCζ/p-GSK-3β/β-catenin轴并证据抗纤维化活性
使用小插手 RNA 铺张成纤维细胞中的Cdc42，此时DA对纤维化的扼制作用消弱；Cdc42过抒发可握续促进肾成纤维细胞的活化并阻断了DA的抗纤维化能力，标明DA的yao效靶点为Cdc42。已知Cdc42 缺失会促进 β-catenin降解，该进程由卵白激酶Cζ (p-PKCζ )和糖原合酶激酶 3β (p-GSK-3β) 磷酸化减少介导。p-GSK-3β 的减少本体上对应于 GSK-3β 的增多，后者通过在 Ser33/37/Thr41 处磷酸化 β-catenin 激勉卵白水解。因此运筹帷幄假设Cdc42通过调遣p-PKCζ/p-GSK-3β/β-catenin轴来调遣肾成纤维细胞活化。考证的斥逐与假设斥逐个致。
图7. DA通过靶向Cdc42激活了p-PCKζ/p-GSK-3β介导的S33/37/T41位点的β-catenin磷酸化
8、Cdc42抒发升高与小鼠和东说念主肾纤维化关连
为了揭示Cdc42与CKD患~者肾纤维化的临~床关连性，运筹帷幄查询了人人基~因抒发谱，发现CKD患~者的Cdc42转录水平远高于健康供者（图8B）。此外，Cdc42与纤维化基~因Acta2、Col1a、Col3a1、Fn1的抒发呈权臣正关连（图8C）。CKD患~者和健康对照者的肾脏标本免疫组化斥逐显现，在健康肾脏中，Cdc42在小管和肾小球中少许抒发，而在小管间质室中险些检测不到。比拟之下，在CKD患~者肾脏的小管、肾小球和间质中检测到Cdc42的权臣增多（图8D），示意Cdc42参与肾脏纤维化。总而言之，这些斥逐标明Cdc42的高抒发与肾纤维化密切关连，因此yao物扼制Cdc42可能成心于CKD患~者。
图8. Cdc42在UUO小鼠和CKD患~者中均有较高的抒发
运筹帷幄论断：
DA是一种自然的小分子二萜，它从yao用植物黄芫花均区分出来，是一种高效的抗纤维化yao物，大致阻断肾成纤维细胞的激活，减轻小鼠模子中的肾纤维化，它比阳性对照吡非尼酮更有用。从机制上说，DA与Cdc42纠消失扼制其活性，从而缩短下贱p-PKCζ和p-GSK-3β水平，导致p-β-catenin （Ser33/37/Thr41）上调，并通过泛素-卵白酶体阶梯对β-catenin进行卵白降解。
参考文件：
Hu X, Gan L迪士尼彩乐园博彩, Tang Z, Lin R, Liang Z, Li F, Zhu C, Han X, Zheng R, Shen J, Yu J, Luo N, Peng W, Tan J, Li X, Fan J, Wen Q, Wang X, Li J, Zheng X, Liu Q, Guo J, Shi GP, Mao H, Chen W, Yin S, Zhou Y. A Natural Small Molecule Mitigates Kidney Fibrosis by Targeting Cdc42-mediated GSK-3β/β-catenin Signaling. Adv Sci (Weinh). 2024 Apr;11(13):e2307850. doi: 10.1002/advs.202307850. Epub 2024 Jan 19. PMID: 38240457; PMCID: PMC10987128.
发布于：四川省