迪士尼彩乐园应用 Piezo1介导的M2巨噬细胞机械转导通过分泌和激活转换滋长因子
发布日期：2024-12-13 20:50 点击次数：50
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骨骼是一种动态组织，通过两种互助邃密的历程不断自我重塑：骨酿成和骨罗致。为了鼓吹骨再生医学的发展，领会骨再生的细胞和分子机制被以为是至关艰巨的。尽管力量不错将参数传递给参与免疫关系行为的细胞，但在骨骼重建本领，免疫细胞处于压力和负荷之下，它们在免疫中的变装尚未被十足分析。巨噬细胞是多功能的免疫系统细胞，关于机械刺激劝诱的代谢收尾至关艰巨。Piezo1是一种非采用性钙通说念，抒发在多种组织中以传递机械信号。在这里，使用细胞张力模子说合机械拉伸对巨噬细胞表型转换偏执机制的影响。禁受波折共培养系统探索巨噬细胞激活对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的影响，以及使用跑步机跑步模子来考据体外说合的体内机制。巨噬细胞检测到的机械应变通过Piezo1导致p53的乙酰化和去乙酰化。这一历程大意使巨噬细胞极化为M2型，并分泌转换滋长因子-beta（TGF-β1），随后刺激BMSCs的搬动、增殖和成骨分化。敲低Piezo1阁下了巨噬细胞向开发表型的转换，从而影响骨骼重塑。阻断TGF-β I、II型受体和Piezo1权贵镌汰了劝诱增多的小鼠骨质料。总之，作家展示了机械张力通过Piezo1引起钙内流、p53去乙酰化、巨噬细胞极化为M2型和TGF-β I开释。这些事件撑合手BMSC成骨。
张开剩余88%1.机械张力劝诱巨噬细胞极化
先前的体外实验还是证据M2型巨噬细胞不错劝诱间充质干细胞（MSCs）成骨细胞分化。作家提议假定，机械张力将刺激M2型巨噬细胞转换，促使骨髓间充质干细胞（BMSCs）启动成骨历程。使用Phalloidin对巨噬细胞在机械拉伸前后进行染色。跟着加快期的延迟，巨噬细胞上出现了更多的伪足，标明存在更多的M2型巨噬细胞。为了说合巨噬细胞对张力的极化反馈，应用Western blot分析M1和M2极化巨噬细胞的比例（图1B）。流式细胞术分析自满，应力改变了巨噬细胞的表型（图1C）。M2型巨噬细胞在第二小时的增多更为权贵。这些收尾标明，张力以时辰依赖性神色导致巨噬细胞极化为M2型，张力的效用在2小庸俗变得愈加显著。因此，采用2小时当作进一步说合的时辰点。
图1. 机械张力劝诱巨噬细胞极化
2. 张力下的巨噬细胞要求培养基促进了BMSCs的增殖和搬动
为了闇练巨噬细胞滋生的培养基对BMSCs搬动是否有影响，作家将BMSCs和巨噬细胞进行了波折共培养（图2A）。收尾自满2小时的张力具有最大的搬动后劲（图2B），各处分组的BMSCs均自满出权贵更高的增殖后劲，其中2小时张力的收尾最高（图2C-D），自满出比对照组BMSCs更大的侧向搬动才略（图2E）。鉴于此，受到压力的RAW 264.7细胞的要求培养基权贵增多了BMSCs的搬动，标明它可能通过增强干细胞归巢对组织愈合产生积极影响。
图2. 张力下的巨噬细胞要求培养基促进了BMSCs的增殖和搬动
3.巨噬细胞滋生的培养基促进BMSCs的成骨分化
为了说合巨噬细胞免疫反应酬成骨分化的影响，BMSCs在不同本领张力要求下的巨噬细胞要求培养基中被劝诱分化为成骨细胞。在2小时拉伸组中，BMSCs的成骨后劲权贵增多（图3A-B）。2小时组的矿化进程权贵高于对照组（简短两倍）。与矿化进程一致，2小时拉伸刺激的BMSCs要求培养基中Col1、Runx2、Osx和Opn的成骨mRNA和卵白抒发水平权贵上调（图3C-D）。左证上述发现，2小时的拉伸可能通过收尾免疫环境中M2型巨噬细胞的极化来促进成骨。
图3. 巨噬细胞滋生培养基促进骨髓间充质干细胞成骨分化
4. Piezo1关于机械力劝诱的M2型极化是必需的
为了细目为什么施加应力会影响巨噬细胞的极化，作家检测了钙离子信号。钙离子的荧光强度跟着施加张力的时辰而变化，在2小庸俗钙离子的大齐内流。然后作家检测了巨噬细胞中的钙关系离子通说念，发现与其他通说念比拟，Piezo1的抒发超越高（图4A）。因此作家假定，张力劝诱的巨噬细胞极化与Piezo1介导的钙内流密切关系。并基于Piezo1抒发水平的数据库，在Piezo1敲低后，发现了p53信号通路（图4B）。细胞免疫荧光自满，与对照组和其他时辰点比拟，张力施加后1小时乙酰化p53的荧光强度特地高（图4C）。此外，敲低Piezo1后增多了乙酰化p53的抒发（图4E）。由于乙酰化p53与iNOS的变化一致，作家思知说念Piezo1的穷乏是否会改变巨噬细胞的极化。收尾标明，在Piezo1激活组中险些所有的巨噬细胞齐是M2型，而Piezo1敲低组中iNOS的抒发险些是对照组的一半（图4F-G）。因此，以为Piezo1关于巨噬细胞向M2表型的鼎新是必不行少的。
图4. 机械劝诱的M2极化需要Piezo1
5. 敲低Piezo1艰苦了BMSCs的增殖、搬动和成骨分化
Yoda1先前已被细目为Piezo1的特异性旺盛剂，在向培养基中添加1 μL/mL的Yoda1并施加2小时的机械张力后，不雅察到巨噬细胞中钙离子内流权贵增多（图5A）。此外，BMSCs的搬动和增殖与钙离子内流的收尾相匹配。在Piezo1敲低后，迪士尼彩乐园巨噬细胞的要求培养基对BMSCs的影响很小（图5B-C）。作家进一步检查了BMSCs的成骨分化才略。Piezo1过抒发后，巨噬细胞的上清液大大增多了BMSCs的成骨才略。违抗，在巨噬细胞露出于2小时的张力后，敲低Piezo1对要求培养基中的BMSCs影响很小（图5D-F）。总体而言，Piezo1关于机械力的传递至关艰巨，以致窜改机械张力是否大意影响巨噬细胞极化，进而影响BMSCs的搬动、增殖和成骨分化。
图5. 敲低Piezo1阁下了骨髓间充质干细胞的增殖、搬动和成骨分化
6. M2型巨噬细胞通过分泌TGF-β1促进BMSCs的成骨分化
以上收尾标明，Piezo1导致巨噬细胞极化为M2型，这一历程影响了BMSCs的搬动、增殖和成骨。巨噬细胞极化后产生的TGF-β1和其他细胞因子对BMSCs的成骨有影响。作家评估了张力下巨噬细胞分泌TGF-β1的抒发，收尾自满，在2小庸俗机械张力大意刺激TGF-β1的分泌。在不同的处分组中，BMSCs在添加不同剂量的TGF-β1抗体到波折共培养系统后12-48小时进行的CCK8实验中自满出增殖后劲的镌汰（图6C），用0.5ug/ml TGF-β1抗体处分的BMSCs具有最低的搬动才略（图6D），TGF-β1抗体休养权贵镌汰了BMSCs的成骨抒发（图6E-F）。因此，作家得出论断，机械张力导致巨噬细胞极化为M2型并开释TGF-β1，反过来不错促进BMSCs的搬动、增殖和成骨分化。
图6. M2巨噬细胞通过分泌TGF-β1促进骨髓间充质干细胞成骨分化
7. 使用TGF-β受体I、II阁下剂或Piezo1阁下剂处分的小鼠推崇出较差的骨骼重塑
骨骼酿成是一个波及骨骼和免疫系统之间相互作用的复杂历程。为了说合Piezo1和TGF-β1在骨骼再生中的作用，作家开发了一个跑步模子。诀别打针水、Piezo1阁下剂（GsMTx-4）或TGF-β受体I、II阁下剂（LY-364947）。跑步权贵增多了小鼠的骨质料，但当Piezo1被阁下时，机械力传递也被阻断，打针GsMTx-4的小鼠骨质料险些与对照组（即不跑步组）是换取的。巨噬细胞开释的TGF-β1在TGF-β受体I、II被阻断后未能阐发作用，导致小鼠胫骨严重骨开发不良（图7A）；跑步组的骨小梁数目权贵增多（图7B）；跑步大大提高了F4/80阳性巨噬细胞分泌的TGF-β1，但Piezo1阁下剂权贵阁下了这一效应（图7C）。因此，Piezo1的阁下大幅镌汰了巨噬细胞分泌的TGF-β1，从而减少了劝诱引起的体内骨质料增多。
图7. TGF-β1和Piezo1的敲低均可镌汰跑步小鼠的骨重塑
图8. 机理图
论断
总之，作家发现机械力通过Piezo1介导的变化，影响了钙离子内流、p53的乙酰化和去乙酰化，劝诱巨噬细胞极化为M2型，分泌TGF-β1，并促进BMSCs的成骨作用（图8）。这一发现标明，Piezo1介导的巨噬细胞机械信号传导是骨免疫学的基础。它为明天的临床骨创伤、骨质疏松症和骨牵引休养提供了陈迹。
在该说合中，说合东说念主员使用了赛昂斯小动物跑步机（Sansbio，型号SA101）来进行实验操作。
小动物跑步机（SA101）
动物跑步机主要用于大小鼠偏执他动物西席和推陈出新说合, 可使西席量化愈加准确；是动物体能、耐力、劝诱损害、运转养分药物、劝诱生理和病理等说合的必要实验开拓。
居品特色
1、刺激电压40-200V可调，刺激电流0-15mA可调；
2、刺激频率可调：2-1000HZ可调；
3、刺激方法：多极性变频刺激，无刺激盲区；
活动中，团队成员们了解到园区以高于市场价的价格收购村民的青稞，加工成青稞饼干、青稞生粉、青稞熟粉等无公害高原特色产品。售卖青稞特产的工作人员表示，以青稞饼干为例，产品主要销往沿海地区，供不应求。青稞园不仅提高了青稞产业附加值，更重要的是解决了当地群众卖粮难的问题。“在这个园区，生产车间整洁干净，原料库房里散发着特有的青稞香气。” 团队成员邱中权说到。
4、推行信息可剪辑，包含动物属性、实验建树；
5、教导声频率500-20KHz可调，强度可调；
6、灯光刺激：爆闪方法1-2000Hz可调，亮度可调；
7、劝诱方法：匀速、多区段、自界说；
8、精准记载灵验劝诱数据，自动去除被电击时劝诱数据；
9、数据导出：USB导出（推行信息、劝诱数据）；
10、速率收尾边界 0-100m/min，精度 0.01m/min；
11、加快度窜改边界：0-100m/min²，精度1m/min²；
12、跑说念长度目田窜改迪士尼彩乐园应用，大小鼠配有不同宽度跑说念罩。
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